Código: 13-BR300-50 – Apresentação: 50 Extrações
Instruções de Uso
1 Uso pretendido
Os reagentes para extração e purificação de DNA, emprega colunas de sílica (cartuchos/filtros). O seu uso é recomendado para amostras de sangue total, plasma, soro, culturas de células, urina, amostra de coleta de swab nasofaríngeas.
O material genético extraído e purificado estará pronto para ser utilizado em kits de biologia molecular como PCR, RT-PCR, RT-qPCR disponíveis no mercado.
2 Características do Produto
Os reagentes para extração de DNA é um sistema genérico que utiliza a tecnologia de colunas de sílica com capacidade de ligação para isolamento e purificação de DNA de amostras de sangue total, plasma, soro, culturas de células, urina, amostras de coleta de swabs nasofaríngeas para procedimentos de diagnóstico in vitro.
2.1 Composição dos reagentes:
| Componentes (50 extrações) | Quantidade de mL fornecida por frasco | Quantidade |
| Hemalise-RBC 10X | 9,0 mL | 01 |
| Tampão de Lise | 20,0 mL | 01 |
| Solução de lavagem A | 30,0 | 01 |
| Solução de lavagem B | 30,0 | 01 |
| Tampão de Eluição | 5,0 | 01 |
| Coluna de Sílica | – | 50 unid. |
| Tubo coletor | – | 50 unid. |
2.2 Especificações
Os reagentes oferecem uma extração em coluna de sílica com excelente rendimento. Uso recomendado com matrizes biológicas respiratórias, sangue e meios de transporte. O DNA extraído poderá ser utilizado em técnicas de biologia molecular, incluindo reação em cadeia da polimerase quantitativa (PCR, qPCR).
2.3 Equipamentos, reagentes e insumos não fornecidos
- Centrífuga – 20.000 x g (14.000 rpm),
- Micropipetas e ponteiras de 1-10L – 100-1000L
- Agitador tipo Vórtex,
- Bloco de aquecimento, Banho Maria, Banho seco ou estufa, para incubação em 56°C.
- Etanol absoluto (95-100%),
- Microtubos de 1,5mL e 2mL,
- Tubos graduados, tipo Falcon (15mL e 50mL).
- Luvas descartáveis.
Preparo de reagente Tampão de Lise, Tampão de Lavagem A e B e tampão de eluição: reagentes prontos-para uso, indicar a data do primeiro uso.
Preparo de Hemalise na concentração 1X: Para cada amostra serão necessários 1,8 mL de solução de Hemalise 1X. Diluir 1:10 a solução de Hemalise-RBC 10X em água ultrapura, sendo 1 parte de Hemalise RBC 10X e 9 partes de água ultrapura, deixando na concentração 1X.
3 Armazenamento e transporte
Os componentes podem ser transportados em temperatura ambiente (10° a 30°C) e são estáveis até a data de validade descrita na embalagem. O tampão de lise e o Tampão de lavagem A podem exibir precipitados devido às baixas temperaturas. Se isso ocorrer, aquecer o frasco em temperaturas entre 55°C a 65°C homogeneizando ocasionalmente até a dissolução completa.
4 Validade
Os reagentes para Extração e Purificação de DNA tem validade de 12 meses quando mantidos fechados e armazenados corretamente.
5 Informação de Segurança
Os reagentes devem ser utilizados somente por pessoal técnico qualificado e devidamente treinado.
- Todo o pessoal envolvido na execução do ensaio deve utilizar equipamentos de proteção individual. Além disso, todos devem ser treinados em procedimentos de biossegurança, como recomendado pela legislação em vigor.
- O ambiente do laboratório deve ser controlado, a fim de evitar contaminantes como poeira ou agentes microbianos transportados pelo ar.
- Após o recebimento dos reagentes, verificar se as embalagens dos componentes estão danificadas ou se há vazamento dos líquidos. Proteger-se adequadamente e caso seja necessário realizar a reclamação correspondente.
- Não utilizar componentes danificados, pois eles podem gerar baixo rendimento.
- Não trocar os componentes diferentes, se não forem do mesmo lote.
- Não utilizar os reagentes após a data de validade apresentada na etiqueta externa.
- Armazenar os químicos e plásticos em condições próprias para uso em laboratório. Para minimizar risco de contaminações é recomendado trabalhar em cabine de fluxo laminar.
- Evitar contaminação cruzada das amostras utilizando ponteiras descartáveis e trocando-as após cada pipetagem. Utilizar ponteiras com filtro.
- Evitar contaminação cruzada entre os reagentes dos reagentes utilizando ponteiras descartáveis e trocando-as após cada pipetagem. Utilizar ponteiras com filtro.
- Caso sejam necessárias mais informações a respeito do produto, favor entrar em contato com o fabricante.
6 Procedimento
Sangue total, soro, plasma, urina, cultura de células, amostra de coleta de swab nasofaríngeas, podem ser processados com os reagentes de extração de DNA em coluna. Para uma purificação satisfatória é importante obter material homogêneo, limpo e não viscoso antes de carregar as colunas. Desta forma, é importante verificar a existência de precipitados em todas as amostras (especialmente amostras antigas e congeladas).
6.1 Preparação das amostras
Os reagentes para extração de DNA foram desenvolvidos para purificação a partir de 200L de amostras de sangue total, soro, plasma, cultura de células.
Para amostras nasofaringes a partir de 300L.
Para amostras de urina centrifugar 2mL para uso do pellet (vide 7.1).
6.2 Amostra de Sangue total: pré-tratamento:
- Em microtubo de 2 mL, adicione 200 µL de sangue total com anticoagulante.
- A seguir, adicione 1,8 mL de solução de hemalise 1X.
- Inverter o microtubo por 10 vezes para homogeneizar a solução de hemalise.
- Incubar a temperatura ambiente por 10 minutos.
- Centrifugar o microtubo a 20.000 x g (14.000 rpm) durante 3 minutos.
- Desprezar o máximo possível do sobrenadante pipetando no lado oposto do pellet.
- Seguir para o protocolo geral, item 7.1.
6.3 Amostra de urina: pré-tratamento:
- Em um microtubo de 2 mL adicionar 2 mL de urina.
- Centrifugar a 20.000 x g (14.000 rpm) durante 5 minutos,
- Desprezar o máximo possível do sobrenadante pipetando no lado oposto do pellet.
- Seguir para o protocolo geral item 7.1.
7 Protocolo geral
7.1 Em um microtubo de 2 mL com a amostra (volume sugerido no item 6.1), adicionar 400 µL do Tampão de Lise.
7.2 Vortexar o microtubo por 15 segundos.
7.3 Centrifugar rapidamente para remover as gotas de líquido da tampa do microtubo.
7.4 Incubar a temperatura ambiente por 10 minutos.
7.5 Adicionar ao mesmo microtubo 200 µL de Etanol Absoluto (Não fornecido).
Homogeneizar imediatamente por inversão.
NOTA: a homogeneização deve ser imediata para evitar qualquer precipitação irregular do DNA devido às altas concentrações do etanol.
7.6 Vortexar o microtubo por 15 segundos.
7.7 Centrifugar rapidamente para remover as gotas de líquido da tampa do microtubo.
7.8 Transferir os 600 µL da amostra preparada na coluna de sílica já acoplada ao tubo coletor.
NOTA: Não descartar o volume restante da amostra preparada (aproximadamente 500L)
7.9 Fechar a tampa da coluna de sílica e centrifugar a 6.000 x g (8.000 rpm) durante 1 minuto.
7.10 Descartar o líquido do tubo coletor e acoplar novamente a coluna de sílica.
7.11 Se necessário repetir o item 8 e 9, caso tenha ficado o preparo da amostra no microtubo.
7.12 Adicionar 600 µL do Tampão de Lavagem A na coluna de sílica já acoplada ao tubo coletor.
7.13 Fechar a tampa da coluna de sílica e centrifugar a 6.000 x g (8.000 rpm) durante 1 minuto.
7.14 Descartar o líquido do tubo coletor e acoplar novamente a coluna de sílica.
7.15 Adicionar 600 µL do Tampão de Lavagem B na coluna de sílica já acoplada ao tubo coletor.
7.16 Fechar a tampa da coluna de sílica e centrifugar a 20.000 x g (14.000 rpm) durante 3 minutos.
7.17 Descartar o líquido do tubo coletor e acoplar novamente a coluna de sílica.
7.18 Centrifugar novamente a 20.000 x g (14.000 rpm) durante 1 minuto para remover completamente a solução de lavagem.
7.19 Transferir a coluna de sílica para um microtubo de 1,5 mL.
7.20 Aplicar 100 µL do Tampão de Eluição diretamente à membrana de sílica.
7.21 Incubar a temperatura ambiente por 2 minutos.
7.22 Fechar a tampa da coluna de sílica e centrifugar a 6.000 x g (8.000 rpm) durante 1 minuto.
7.23 Manter o DNA eluído a -20°C para armazenamento e/ou transporte ou utilizá-lo imediatamente.
8 Controle de Qualidade
| PROBLEMA | CAUSA PROVÁVEL | RECOMENDAÇÃO |
| Baixo desempenho do DNA eluído em aplicações laboratoriais | Amostras antigas ou armazenadas inadequadamente | Evitar congelamento/descongelamento repetitivo |
| Baixo desempenho do DNA eluído em aplicações laboratoriais | Inibição ineficiente de nuclease durante a fase de lise da amostra | Verificar se o tampão de lise tenha sido misturado homogeneamente com a amostra |
| Baixo desempenho do DNA eluído em aplicações laboratoriais | O etanol não foi adicionado após a lise da amostra | Repita a purificação com nova alíquota de amostra |
| Baixo desempenho do DNA eluído em aplicações laboratoriais | Tampão de Lise e Tampão de lavagem A não estão totalmente homogêneos | Corrigir a homogeneização dos tampões, verificando que estejam completamente dissolvidos sem precipitado nem cristais devido à baixa temperatura |
| Baixo desempenho do DNA eluído em aplicações laboratoriais | A coluna de sílica não foi suficientemente seca antes da adição do tampão de eluição | Verificar que a coluna seja centrifugada após a adição do tampão de lavagem B, a velocidade máxima por 3 minutos seguida por 1 minuto |
| Baixo desempenho do DNA eluído em aplicações laboratoriais | DNA degradado | Processar a amostra imediatamente ou se for armazenada, verificar para que seja descongelada gentilmente em baixa temperatura |
9 Garantia da Qualidade
Garantia contra defeitos de produção pelo período de validade do produto, salvo especificações em contrário a constar da proposta.
A garantia abrange defeitos de produção.
Exceções na garantia:
Todos os produtos com defeitos oriundos de mau uso, imperícia, conservação ou armazenagem inadequada.
Quando não for utilizado de acordo com sua finalidade de aplicação.
